Minicircle-DNA enthält praktisch nur das „Gene of Interest“ (GOI). Unnötige, nur für den Herstellungsprozess von Plasmiden verwendete Sequenzen wurden komplett entfernt. Ein sicheres, hocheffektives Vektorsystem ist das Ergebnis. Schon heute erfüllt es die regulatorischen Anforderungen der Zukunft für die Gentherapie und Vakzinierung.
PlasmidFactory hat das erste Minicircle-DNA-Produkt auf den Markt gebracht:
Die McBox® enthält jeweils 100 µg zertifizierte Minicircle– und Plasmid-DNA. Beide enthalten jeweils das gleiche Reportergen. Zur Zeit ist die McBox® mit dem Luziferase-Gen (luc), dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) sowie dem ß-Galactosidase-Gen (lacZ) erhältlich.
Damit erhalten Sie als Wissenschaftler die Möglichkeit, PlasmidFactory’s Minicircle-DNA mit dem entsprechenden Plasmid in Ihrer individuellen Anwendung zu vergleichen.
Kundenspezifische Minicircle
Nach Absprache produzieren wir Ihren individuellen Minicircle nach unserer einzigartigen, patentierten Methode.
Ihr Plasmid mit dem gene of interest (GOI) ist das Ausgangsmaterial. Es wird entweder direkt durch cut and paste oder nach Amplifikation mit Hilfe spezieller PCR in das sogenannte „Parental-Plasmid“ eingefügt. Aus diesem Parental-Plasmid, das nun Ihr GOI enthält, wird durch Rekombination das Minicircle-DNA-Molekül hergestellt, welches nahezu ausschließlich aus Ihrem gene of interest besteht.
Die Minicircle-DNA, hergestellt mit unserer firmeneigenen Technologie, ist weltweit patentiert und ausschließlich erhältlich bei PlasmidFactory.
Ein alternativer Ansatz zur Herstellung minimaler DNA-Vektoren, welche nur die für die eigentliche Wirkung notwendige Information enthalten, ist z.B. die MIDGE®-(minimalistische immunologisch definierte Genexpression)-DNA. Die MIDGE-Struktur ist linear und durch einzelsträngige Haarnadelbereiche an beiden Enden fest geschlossen. Dies führt zu der charakteristischen, geringen Größe dieser Moleküle, welche wie die Minicircles bereits in der präklinischen Forschung sowie in klinischen Studien verwendet wurden bzw. werden.
Allerdings weisen derartige lineare Moleküle nicht die für intakte Plasmide und PlasmidFactory´s Minicircles charakteristische Superhelizität auf, sodass Minicircle-DNA aus unserer Sicht das bevorzugte System bei der Wahl des geeigneten DNA-Vektors darstellt.
PlasmidFactory verfügt über die weltweiten Markenrechte für die MIDGE-Technologie.
Minicircle-DNA besteht nur aus dem spezifischen gene of interest und einem sehr kurzen Sequenzabschnitt, der als Rest des spezifischen Herstellungsverfahrens unvermeidlich im Minicircle verbleibt. Im Vergleich zu typischer Plasmid-DNA mit einem als „backbone“ bezeichneten allgemeinen Teil, der die Gensequenz zur Selektion (z.B. gegen Antibiotika) enthält und dem so genannten origin of replication (ori; zur Replikation der Plasmide in E. coli-Zellen), sind Minicircle extrem klein – z. T. nur halb so groß wie Plasmide. Da die backbone-Sequenzen typische Motive prokaryontischer DNA aufweisen und darüber hinaus auch anders methyliert sein können (CpG-Motive), wirken sie sich störend bei der Transfektion eukaryontischer Zellen aus. Wie Qualitätskontrollen zeigen, führt die bei der Minicircle-Herstellung durch PlasmidFactory durchgeführte chromatographische Aufreinigung zu höchster Reinheit der Minicircle-DNA, die im Bereich der Qualität von ccc Grade DNA liegt. Für die Reproduzierbarkeit experimenteller Daten ist es absolut notwendig, hochreine DNA einzusetzen, denn bereits kleinste Kontaminationen können zu erheblichen Artefakten im Experiment führen.
Gründe für den Einsatz von Minicircle-DNA
Die Verbreitung von Antibiotika-Resistenzgenen sowie die unkontrollierte Expression von backbone-Sequenzen haben möglicherweise einen stark negativen Einfluss auf die Genexpression und können Immunreaktionen in den Zielzellen hervorrufen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass unmethylierte CpG-Motive zum gene silencing von episomalen Genen beitragen. In der Vektorentwicklung ist es daher ein wichtiges Ziel, superspiralisierte (ccc) Plasmid-DNA ohne bakterielle Sequenzen herzustellen. PlasmidFactory ist weltweit das erste Unternehmen, dessen Minicircle-Produkte diesen hohen Anforderungen gerecht werden.
Anwendungsbereiche für Minicircle-DNA
Das Produkt ist geeignet für Anwendungen in der Gentherapie, genetischen Impfung, Herstellung von RNA und Virusproduktion – also überall dort, wo bisher Plasmid-DNA zum Einsatz kommt. Minicircle-DNA besteht fast ausschließlich aus den wirksamen Sequenzen. Dies erlaubt die Erhöhung der Dosis, ohne die Menge an DNA zu erhöhen.
Herstellung von Minicircle-DNA
PlasmidFactory’s patentierte Minicircle-Produktionstechnologie wurde für die Produktion hochreiner Minicircle-DNA entwickelt. Das Ausgangsplasmid, das sogenannte Parentalplasmid, ist in einer speziellen Bakterienkultur vermehrbar, durch anschließende Rekombination entstehen zwei zirkuläre DNA-Strukturen – der Minicircle und ein Miniplasmid, das neben der für die Antibiotikaresistenz kodierenden Region u.a. den für die Vermehrung in Bakterien essentiellen origin of replication (ori) enthält. Die Trennung erfolgt durch ein spezielles chromatographisches Verfahren, um die nicht gewünschten Plasmid-Moleküle zu entfernen. PlasmidFactory stellt sowohl Standard-Minicircle (In Stock-Produkte) als auch kundenspezifische Minicircle-DNA her.
Vergleich zwischen Minicircle-DNA und Plasmid-DNA
Minicircle wurden inzwischen in ca. 20 Effizienzstudien getestet. Die Expressionsstärke der Minicircle lag jeweils mindestens auf gleichem Niveau, meistens aber sogar deutlich über der Expressionsstärke des entsprechenden Plasmids mit derselben Expressionskassette. Getestet wurde die Expression in verschiedenen Gewebetypen, Zellen, Tieren und mit verschiedenen Transfektionsmethoden (z.B. Elektrogentransfer, Sonoporation, Lipofektion, Magnetofektion, hydrodynamische Injektion, Jetinjektion etc.). Die PlasmidFactory McBox® enthält jeweils den Minicircle und das entsprechende herkömmliche Plasmid und ist für vergleichende Experimente in Ihrem Labor sehr gut geeignet. Dabei ist zu beachten, dass nur ein equimolarer Vergleich (gleiche Anzahl an DNA-Molekülen – Minicircle oder Plasmid) sinnvoll ist.
CpG-Motiv
Eine Cytosin-Phosphat-Guanosin (CpG) Nukleotidabfolge wird in eukaryontischen Genomen häufig von DNA-Methyltransferasen methyliert. Dieser Mechanismus dient im Bakterium der Abgrenzung von Genprodukten. Eine negative Folge dieser Methylierung kann sich in einer verringerten Expressionsrate des betreffenden Gens äußern. Mittlerweile ist es bei sensiblen Anwendungen möglich, die Zielsequenz so zu gestalten, dass sie einen reduzierten CpG-Gehalt aufweist oder völlig frei von CpG-Motiven ist („Zero-CpG“).
EU Direktive
Die Europäische Behörde zur Evaluierung medizinischer Produkte (EMEA) empfiehlt in ihren Richtlinien für medizinische Gentransferprodukte, dass bei Plasmid-DNA-Produkten auf die Verwendung von Selektionsmarkern, wie Resistenzen gegen Antibiotika, verzichtet werden sollte (CPMP/BWP/3088/99). Um die Produktsicherheit zu erhöhen, haben sich auch nationale Instanzen (z. B. Paul-Ehrlich-Institut, Deutschland, AFSSAPS in Frankreich und MCA im Vereinigten Königreich) dieser Empfehlung angeschlossen.
Als Reaktion darauf hat PlasmidFactory eine „minimalisierte DNA“ entwickelt, die keine Antibiotika-Resistenzgene bzw. andere Selektionsmarker und keinen origin of replication mehr enthält, und dennoch superspiralisiert ist: Die Mincircle-DNA, d.h. homogene zirkuläre Derivate von Plasmid-DNA, welche praktisch ausschließlich aus der präventiv/therapeutisch wirkenden Geneinheit (Kassette) bestehen.
MIDGE®
Ein alternativer Ansatz zur Herstellung minimaler DNA-Vektoren, welche nur die für die eigentliche Wirkung notwendige Information enthalten, ist z.B. die MIDGE®-(minimalistische immunologisch definierte Genexpression)-DNA. Die MIDGE-Struktur ist linear und durch einzelsträngige Haarnadelbereiche an beiden Enden fest geschlossen. Dies führt zu der charakteristischen, geringen Größe dieser Moleküle, welche wie die Minicircles bereits in der präklinischen Forschung sowie in klinischen Studien verwendet wurden bzw. werden.
Allerdings weisen derartige lineare Moleküle nicht die für intakte Plasmide und PlasmidFactory´s Minicircles charakteristische Superhelizität auf, sodass Minicircle-DNA aus unserer Sicht das bevorzugte System bei der Wahl des geeigneten DNA-Vektors darstellt.
PlasmidFactory verfügt über die weltweiten Markenrechte für die MIDGE-Technologie.
Wir, die PlasmidFactory GmbH & Co. KG, nutzen Cookies im Zusammenhang mit unserer Internetpräsenz. Sie können jederzeit selbst entscheiden, ob Sie uns den Einsatz von Analyse-Cookies erlauben möchten. Wenn Sie „einverstanden“ wählen, akzeptieren Sie sämtliche Cookies und erlauben uns, Daten an Dritte weiterzugeben. Sie haben das Recht, Ihre Einwilligung jederzeit mit Wirkung für die Zukunft zu widerrufen. Falls Sie nicht zustimmen, beachten Sie bitte, dass ggf. nicht alle Funktionalitäten der Seite zur Verfügung stehen. Weitere Informationen finden Sie in unseren Datenschutzhinweisen.
